「限制性核酸内切酶的特点」俗人俗事不俗生活

高中生物学：限制性内切酶的知识点和应用

关于限制性核酸内切酶（下面简称限制酶）的定义是：能够识别和切割 DNA 分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。因为限制酶能切割 DNA 分子，所以将其称为“基因的剪刀”、“分子手术刀”等。
1不同的限制酶产生的黏性末端一定不同吗？
不同限制酶识别的碱基序列一般不同，但切割后所产生的黏性末端可能是一样的，像这种能切割不同的 DNA 片段但产生相同黏性末端的一类限制酶称为同尾酶。如 BglⅡ和 BclⅠ，它们的识别位点分别为 AGATCT 和 TGATCA, 但能切出相同的黏性末端，如图 1 所示。
2不同的限制酶识别序列一定不同吗？
不一定。能识别相同序列的限制酶称为同裂酶，但其切割位点可能相同也可能不同。具体可分为以下几种情况：1）同序同切酶。 这些酶的 DNA 识别序列和切割位置都相同，如 MboⅠ与 Sau3AⅠ识别切割位
2）同序异切酶。 这些酶的识别序列相同但切割位点不同， 如 KpnⅠ和 Acc65Ⅰ识别的序列是都GGTACC，但它们的切割位点不同，如图 3 所示。
3）同功多位酶 。 一些能识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。 如 EcoRⅠ识别和切割位点为 GAATTC，ApoⅠ识别和切割位点为NNAATTNNN，后者可识别并切割前者的序列。
3限制酶的DNA识别序列一定为回文序列吗？
DNA 中的一段倒置重复序列 ，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构，这段序列被称为回文序列。 其特点是在该段的碱基序列的互补链之间正读反读都相同（并非在同一条链上正读反读）。例如正读：5′GGTACC3′，反读：3′CCATGG5′。1）  回文序列 ： 限制酶识别的序列大多数为回文序列， 切割位点在DNA2条链相对称的位置。回文对称结构的序列经限制酶切割后， 产生的末端为匹配黏性末端， 这样形成的 2 个末端是相同的，也是互补的，如图 4 所示。在回文对称轴上同时切割 DNA 的 2 条链，可能产生平末端，产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较黏性末端低，如图 5 所示。2）  非对称序列有一些限制酶的识别序列是不对称的。 当识别序列为非对称序列时，切割 DNA产生的黏性末端是不同的，称为非对称突出端。如BbvCⅠ，它的识别切割位点见图 6。
4限制酶的切点一定在识别序列内部吗？限制酶对 DNA 的切割位点大多数在识别序列内部，但也有在识别序列外部的，如图 7 所示
51种限制酶一定只能识别1种核苷酸序列吗？
多数的限制酶只能识别 1 种特定的核苷酸序列，但也有例外,如前面所讲的同功多位酶，能够识别多种核苷酸序列，如图 8 所示。
6目的基因的获取一定用到限制酶吗？
在浙科版“现代生物科技专题”第 5 页中提到获取目的基因通常有 2 种方法，序列已知可以用化学方法合成或者用 PCR 扩增目的基因，序列未知可以从基因文库中获取目的基因。但在实际题目中往往是让学生选择用哪种限制酶去获取目的基因，容易使学生形成“目的基因的获得一定用到限制酶”这样的错误认知。在构建某种生物的基因文库时常用到限制酶，通常是将某种生物材料的遗传物质 DNA 用限制酶切成片段，插入到载体分子中，并将重组载体转入宿主细胞，然后再用某种探针选择、钓取目的基因。 但是用化学合成法或PCR扩增目的基因过程中不一定用到限制酶，可见，目的基因的获得不一定需要限制酶。
7构建重组DNA时一定用到限制酶吗？
在浙科版“现代生物科技专题”第 6 页中提到获得目的基因后，要将其与载体 DNA 连接在一起，通常是用相同的限制酶分别切割目的基因和载体 DNA，然后用 DNA 连接酶将目的基因和载体 DNA 连接在一起，形成重组 DNA 分子。从“通常”2 个字可知构建重组 DNA 时不一定用到限制酶，例如，利用 PCR 技术获取目的基因时，通常是用耐热性 DNA 聚合酶（如 TaqDNA 聚合酶等）扩增目的基因序列。 TaqDNA 聚合酶等扩增得到PCR 产物的 3′端附有 1 个“A”碱基，可以在 DNA连接酶的作用下连接到 PCR 产物克隆专用载体（也称为通用载体），如 pMD18-T 载体。在pMD18-T 载体等通用载体插入位点2侧的 3′端添加了一个“T”碱基，这样恰好可以与 PCR 产物末端的“A”碱基配对，得到含有目的基因序列的重组 DNA 分子。这种重组 DNA 分子可以很方便地转化到感受态细胞中，进行 DNA 测序以及后续的相关实验，如图 9 所示。
8构建重组DNA时一定用同种限制酶吗？
构建重组 DNA 时，通常是用相同的限制酶分别切割目的基因和载体DNA，这样会在目的基因和载体的两端形成相同的黏性末端，然后用 DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成重组DNA分子。但是这种情况下的两两连接产物除了重组 DNA 分子，还有目的基因-目的基因连接产物、载体-载体连接产物。为了防止目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时常会选择不同的限制酶。
基因工程中常用两种限制酶酶切质粒和目的基因，可以为防止错误连接及自身环化、和反向链接。但实际操作中要考虑到目的基因两端可能没有两种限制酶的酶切位点；若是人工合成需要人为的加上粘性末端。例12016?全国卷Ⅰ节选：某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(2) 如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是 ①  ；并且 ② 和 ③ 的细胞也是不能区分的。其原因是 ④ 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有 ⑤  的固体培养基。
答案：① 二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长; ②含有质粒载体（空载）;③含有重组质粒;④二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长;⑤四环素
解析：目的基因和载体有同一种酶酶切后，会形成相同的粘性末端，再用DNA链接酶催化时，会有下图的三种情况。且上述题目中，目的基因插入破坏了四环素的抗性基因，因此导入了重组质粒的受体菌，可以在含有青霉素的培养基生长，但不能在含有四环素的培养上生长。例2科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。如图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。 请据图回答问题。（1）图中质粒上有抗氨苄青霉素和抗四环素两个标记基因，经过①和②步骤后，有些质粒上的   基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒，由于目的基因的分隔使得该抗性基因失活。
（2）步骤③是     的过程，为了促进该过程，应该用   处理大肠杆菌。
（3）步骤④将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基Ｃ上培养，目的是筛选   ，能在Ｃ中生长的大肠杆菌有   种
（4）步骤⑤：用无取Ｃ上的单个菌落，分别接种到Ｅ（含四环素），然后用影印法接种到D（含氨苄青霉素和四环素）上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的   菌落位于   （填Ｄ或Ｅ）上，请在图中相应的位置上圈出来。
答案（1）氨苄青霉素抗性；（2）将重组质粒（目的基因）导入大肠杆菌（受体细胞）CaCl2溶液；（3）含四环素抗性基因的大肠杆菌 ２ ；（4）E例32018浙江温州3月选考模拟 利用图示质粒和目的基因培育转基因醋化醋杆菌。图中标注了相关限制性核酸内切酶的识别序列和酶切位点,其中酶切位点相同的酶不重复标注。请回答下列有关转基因的问题:(1)利用图示质粒和目的基因构建重组质粒,应选用　　　　  两种限制酶切割。
解析：为防止错误连接（包括反向链接）和自身环化应采用BamHⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶切割。
2020年1月浙江高考29：为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用____________，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的粘性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中________，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
答案：两种限制性核酸内切酶 扩增
第一空考查了限制酶切割的两种方式，即黏性末端和平末端是怎样产生的。常规的考法就是这样：
裸奔式：目的基因的获取需要     酶切割。情景式：从图中选择目的基因插入的位置，需要具体什么酶。
关于限制酶的考题方式：
一、酶切结果的推导限制酶作为酶类，决定其催化作用具有高效性、专一性和作用条件温和等特点。其中专一性的具体表现为：某种限制酶只能催化DNA上特定序列特定位点的磷酸二脂键水解，结果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。限制酶所识别的双链DNA上的序列具有“回文对称”性质，即无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，即错位平切，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，即平切，产生平末端。错位切的限制酶在基因工程中最常使用，因为与平末端相比较，黏性末端更有利于DNA片段的连接。例1下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图（↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端）：限制酶1：——↓GATC——；    限制酶2：——CATG↓——；限制酶3：——G↓GATCC——；    限制酶4：——CCGC↓GG——；限制酶5：——↓CCAGG——。请指出下列哪组表达正确（ ）A．限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对B．限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同D．限制酶1和2剪出的黏性末端相同二、酶切方法的选择构建重组质粒，需要用限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和质粒，切割方法主要有单酶切和双酶切。单酶切是指用同一种限制酶对含目的基因的DNA和质粒进行切割，目的基因序列的两边必须各有一个能被该限制酶识别的序列及切点，而质粒至少有一个识别序列及切点，这样被切割的质粒与切下的目的基因两边形成相同的黏性末端，以实现连接而形成重组质粒，有时也可以用两种不同的限制酶（同尾酶）切割产生相同的黏性末端。双酶切是指用两种限制酶进行切割，含目的基因的DNA和质粒上都必须有能被这两种限制酶识别的序列及切点，结果两者都会产生具有两种不同的黏性末端的DNA片段，两个末端分别用A与B表示，然后混合起来，那么载体分子的A端与目的基因的A端连接，载体分子的B端与目的基因的B端连接，形成重组DNA分子，这样就可以避免DNA连接酶催化时被切割后的质粒自连成环的现象，并能保证质粒与目的基因的定向连接。例2基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。根据图示,判断下列操作正确的是(   )A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割三、酶切图谱的构建酶切图谱是指选取某一特定长度的DNA分子，用多种限制酶单独或联合切割，再通过电泳技术将酶切片段进行分离，计算相对大小，以确定每一种限制酶在DNA分子中的切点位置和相对距离，并据此绘制而成的物理图谱（一般以直线或环状图式表示）。例3.用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1kb即1000个碱基对)，请在下图中画出质粒上EcoRⅤ、MboⅠ的切割位点。参考答案：
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限制性核酸内切酶的特点 - 去除核酸中蛋白质的方法有哪些

　　现在很多人都说自己的湿气啊，特别特别的重，那湿气到底从哪里来的呢？怎样祛湿气才简单又有效？今天和医生一次给大家讲明白！
　　湿气主要是从三个方面来的，一个是我们“补给”的太多，第二个是“用的太少”，最后一个啊，就是能“排出去”的少。
　　简单地说啊，就是平时啊，喜欢吃一些高营养的食物，还爱吃一些呢，像甜品啊，奶茶啊，饮料这种甜食、油腻的食物，或者说像一些精细的粮食，或是富含很多碳水的食物呢，过多食用，都可能生湿生痰。
　　第二，“用得太少”，其实啊，主要就是两个原因，第一就是脾虚，中医上认为啊，脾主运化，如果脾气虚啊，就很容易出现，无法有效地运化食物，或者无法有效地运化水湿，第二呢，就是我们运动得太少了，我们身体需要供给就那么多，所以呢，也只需要吸收这么多的水谷精微，这两种情况啊，都可能让我们生湿生痰。
　　最后一个就是湿气不能很好地排出去，那正常来说，湿气是怎样排出来的呢？当然不是通过小便和发汗的形式出来，这些只是我们临床上啊，用的治病祛湿的手段，正常排湿的因素啊，关键在于肾，我们的肾阳啊，它具有气化的作用，就想到于烘烤机一样，把身体里的“水”啊，给烘烤一下，把里面的精微物质啊向上给蒸腾，供我们身体二次使用，然后呢，把不需要的废水啊，下放到膀胱，通过小便的形式啊，给排泄出去，那如果说，肾阳不足啊，也会出现生湿生痰的情况。那怎样有效祛湿呢？
　　其实啊，很简单，根据我们上面说的啊，总结的，有三点，第一就是管好嘴，多动动，第二呢，就是健脾胃，最后一点呢，就是温肾阳。
　　管好嘴，多动动，就是平时啊，我们要合理规划因素，这些油腻、营养过剩的食物也不是不能吃，但是不能经常吃，并且啊，适当的运动运动，别一条到晚，闷在家里，躺在床上玩手机，其实玩久了也感觉没啥意思，感觉挺空虚的，多出去充实一下生活，运动运动，适当的出出汗，好处很多。
　　第二啊，就是健脾胃，如果是脾气虚了啊，多见少气懒言，肢体啊，倦怠乏力，很容易肚子胀或者拉肚子，大便还不成形，还很黏腻，很难冲下去，伸出舌头一看呢，舌体胖大，或有齿痕，这个时候呢，可以参考一个参苓白术丸，但是啊，如果说你已经发展到痰湿了，就是每天昏昏沉沉的，感觉没精神，并且啊，总是想吐痰，嗓子总有痰，这个时候啊，可以参考一个二陈丸。
　　第三个就是温肾阳，如果是你平时啊，手足不温，畏寒怕冷，并且啊，还有腰膝酸软，小便清长，夜尿频多，欲望低下，并且啊，还爱出虚汗，这个时候呢，可以参考一个桂附地黄丸。
　　当然了，如果能配上几个穴位啊，那效果会更好，今天和医生啊，给大家分享三个穴位，一个是非常补脾的穴位，一个是非常能祛湿的穴位，一个是非常能化痰的穴位。
　　首先啊，很能健脾的穴位呢，就是太白穴，中医上有句话啊，就是脾虚必灸太白，它呢，就在我们的脚上，艾灸或者揉按它啊，可以很好地补脾健脾，然后祛湿的穴位呢，就是阴陵泉穴，阴陵泉啊，是我们renti中，祛湿的要穴，它呢，在我们的小腿上，现在很多人啊，因为湿气大啊，稍微按一下，揉一下啊，这个穴位就疼，我们也可以通过啊，艾灸或者揉按的方式来刺激这个穴位。
　　最后一个化痰的穴位呢，非丰隆穴莫属了，丰隆穴啊，是我们临床化痰啊，绕不开的一个穴位，这个穴位呢，如果你的痰啊，是白的稀的为主啊，可以艾灸它，如果说啊，是黄痰为主啊，我们可以揉按啊，效果很好。
　　那只说了这三个穴位了，那怎样去操作呢？我们啊，如果是揉按啊，可以早晚揉按50次，最多也就花个3～5分钟，以出现啊，酸、胀、痛感最好，那如果说啊，要艾灸的话啊，我们可以通过悬灸的方式来刺激这几个穴位，每两天灸一次就行，那如果说呢，你一做艾灸就上火啊，那最好是找个专业的医师问清楚是怎样回事，或者呢，就选择揉按这几个穴位。
　　以上呢，就是我分享的湿气到底是怎样来的？又该怎样祛湿最有效！中医教你特效祛湿方法，你学会了吗？关注和医生，健康生活不迷路，我们下次再见！

限制性核酸内切酶的特点 - 验核酸步骤

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1、在weixin中打开“贵州健康码”小程序；
2、点击“新冠病毒核酸检测”进入“贵州核酸检测”；
3、完善个人信息，点击“扫试管”，选择检测类型等信息，并扫描采集条形码；
4、完成个人信息录入后，出示信息给现场工作人员核验。
怎样查询核酸检测结果呢？
1、打开“贵州核酸检测”小程序，点击右下方的个人中心；
2、在“核酸检测卡”中，就可查看检测报告了。
对了！我们再次提醒您，排队等待检测时，请注意保持1米以上距离。
遵义，加油，我们，在一起。
来源：动静贵州
编辑：吴春妹
编审：邱靖
监制：杨廷兵
总监制：朱光伦
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