核酸水解产物

通用核酸酶-来自微生物的礼物

核酸酶的历史
核酸酶是一类能够水解核酸中磷酸二酯键的酶，科学家根据酶切底物的不同分为核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶。
脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseI)在1905年科学家在牛胰腺中发现，由此核酸酶第一次走进人们的视野。此外，微生物的研究也发现一些微生物能胞外分泌核酸酶，这些磷酸二酯酶能够在胞外降解DNA或RNA，为细菌提供碳源或者起到防护功能。
图1.细菌核酸酶的不同功能[1]
非特异性核酸酶的发现
20世纪五六十年代，金huangse葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等分泌的胞外核酸酶也被陆续分离出来。底物测试发现这些酶对DNA和RNA表现出非专一性，因此被新归类为非特异性核酸酶。
非特异性核酸酶的重大发现是在1957年，Jeffries等科学家首次发现粘质沙雷氏菌能够降解DNA和RNA[2]。1962年Eaves等人在粘质沙雷氏菌的培养液中分离出粘质沙雷氏菌胞外核酸酶（Serratiamarcescensnuclease，SMnuclease）。
经过鉴定，SMnuclease是一种糖类非专一性核酸内切酶，水解核酸后的产物为3～5个碱基长度的5’-单磷酸寡核苷酸，来防止外源DNA摄入。
图2.培养基上细菌对核酸的降解作用[2]
SMnuclease是迄今已知的唯一能水解所有核酸类型的核酸酶，包括单链，双链，线性和环状DNA或RNA，又被称为全能核酸酶。在水解速度上，SMnuclease也是核酸酶家族中独一档的存在，其DNA水解速度是DNaseI的34倍，是金huangse葡萄球菌核酸酶的4倍。
全能核酸酶的商品化
20世纪八十年代以来，重组蛋白等生物药开始进入医药市场。通过微生物发酵的形式生产蛋白，外源的核酸不仅会增加裂解液的粘度，还能在药物生产中降解过多的宿主DNA残留，以规避致癌等风险。
传统生物制药工艺使用层析等方法去除宿主DNA，但成本会比较高。核酸酶能够降解各种形式的（双链，单链，线状，环状，天然或变性）DNA和RNA，SMnuclease作为去除宿主DNA残留更理想的手段开始被人们关注。BenzonPharmaA/S公司最先在大肠杆菌中重组表达了该光谱核酸酶，故名Benzonase[3]。
随着细胞和基因治疗行业在国内的热度高涨，核酸酶作为纯化的关键原料也被生物行业重点关注。由于进口全能核酸酶价格原因和国产化替代趋势，国内供应商开始了自主研发全能核酸酶产品的道路。质量与价格成为了目前核酸酶产品热烈讨论的话题。
Pannarase全能核酸酶
上海逐典出品的Pannarase全能核酸酶，高效、合规、可耐受各种生产条件，专为GMP环节所设计，不失为疫苗、重组蛋白、病毒载体等生物制药行业中去除核酸的理想选择。
产品特点：
Pannarase无动物源性,无氨苄青霉素，可高效降解单链、双链、线性、环状、超螺旋等任何形式的DNA及RNA上游工艺采用包涵体溶解复性技术，比活性更高下游工艺中选择阴阳离子层析替代亲和层析，无需引入His标签，从而消除产品引入金属镍的风险生产车间严格按照GMP体系建设，每批次都有对应的生产批记录标准品定量，质谱均一性认证，肽图Mapping验证，产品批次间稳定性好
参考文献：
[1]SharmaP,GargN,SharmaA,CapalashN,SinghR.Nucleasesofbacterialpathogensasvirulencefactors,therapeutictargetsanddiagnosticmarkers.IntJMedMicrobiol.2019Dec;309(8):151354.doi:10.1016/j.ijmm.2019.151354.Epub2019Aug30.PMID:31495663.
[2]JeffriesCD,HoltamanDF,GuseDG.Rapidmethodfordeterminingtheactivityofmicroorganismsonnucleicacids.JBacteriol.1957Apr;73(4):590-1.doi:10.1128/jb.73.4.590-591.1957.PMID:13428699;PMCID:PMC314626.
[3]Benedik,M.J.,Strych,U.,1998.Serratiamarcescensanditsextracellularnuclease.FEMSMicrobiol.Lett.165,1–13.
今天先聊到这，下一期跟着小编一起看看全能核酸酶结构和功能吧，敬请期待哦。

核酸水解产物 - 核酸的元素组成

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第三章核酸的化学
 
第一节核酸的分子组成
一、核酸的元素组成
主要元素C、H、O、N、P(P元素含量较为恒定,为9%-10%。）
 
二、核酸的基本成分
核酸的基本组成单位是核苷酸。
       核酸(DNA和RNA）
   
            
（一）碱基
碱基是构成核苷酸的基本组成部分之一，属于嘌呤和嘧啶的衍生物。
嘌呤碱：A(腺嘌呤)、G（鸟嘌呤）
嘧啶碱：C（胞嘧啶）、T（胸腺嘧啶）、U（尿嘧啶）
稀有碱基：甲基化衍生物
DNA分子中的碱基：A、T、C、G
RNA分子做的碱基：A、U、C、G
(二）戊糖
戊糖是核苷酸组分之一
β-D-核糖（构成RNA）；β-D-2-脱氧核糖（构成DNA）
（三）核苷（戊糖碱基）
核苷分为两大类：核糖核苷和脱氧核糖核苷
 
三、碱基与戊糖相连形成核苷，核苷与磷酸连接形成核苷酸。
戊糖的C1与嘌呤N9或嘧啶的N1以糖苷键相连形成核苷。
戊糖的碳源子编号加“’”。
核苷的戊糖上的羟基与磷酸结合形成的磷酸酯即核苷酸。
2’-、3’-、5’-三种核苷酸
3’-、5’-两种脱氧核苷酸
游离存在的多为5’-核苷酸
 
第二节  DNA的结构与功能
一、DNA的一级结构
DNA的一级结构是指构成核酸的四种基本组成单位——脱氧核糖核苷酸，通过3’5’-磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体，即脱氧核苷酸从5’→3’端的排列顺序。
 
 二、DNA的二级结构
DNA双螺旋结构的特点：
①DNA由两条反向平行的多聚脱氧核苷酸链组成，为右手螺旋，螺旋直径为2.37nm，螺距为3.54nm；
②由脱氧核糖和磷酸基团构成的亲水性骨架位于双螺旋结构的外侧，疏水的碱基位于内侧；
③DNA双链之间形成了互补碱基对，A与T相配对，形成两2个氢键；G与C相配对，形成3个氢键；
④每一个螺旋平均有10.5个碱基对，每两个碱基对之间的相对旋转角度为36?，相邻碱基平面距离为0.34nm；
⑤碱基对的疏水作用力（碱基堆积力）和氢键共同维系DNA双螺旋结构的稳定，前者的作用更重要。
（2）DNA双螺旋结构的多样性
①B型DNA：又称为B-DNA，即双螺旋结构，为DNA的经典结构。
②A型DNA：当环境的相对湿度降低后，DNA仍然为右手双螺旋结构，但空间结构参数发生变化。
③Z型-DNA：为左手螺旋的结构特征的DNA。
               
三、DNA的超级结构
1.原核生物DNA的结构：   
    (1)绝大部分原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋分子。在细胞内，这种双螺旋分子还需再次盘绕形成超螺旋结构。在细菌DNA中，超螺旋可以相互独立存在，形成超螺旋区。
（1）正超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方向相同。
（2）负超螺旋：盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。大部分原核生物DNA是环状的双螺旋分子，且以负超螺旋的形式存在。
自然界的闭合双链DNA主要是以负超螺旋形式存在的。
2.真核生物DNA的结构：
   (1)真核生物的DNA以非常有序的形式存在于细胞核内。在细胞周期的大部分时间里以松散的染色质形式存在，在细胞分裂期形成高度致密的染色体。染色体是DNA的超级结构形式。染色体的基本单位是核小体。 
   (2)核小体由DNA和组蛋白共同构成。组蛋白分子共有5种，分别称为H1、H2A、H2B、H3、H4。各两分子的HA、HB、H3和H4共同构成了核小体的核心，称为组蛋白八聚体（又称核心组蛋白）。
(3)核小体的形成仅是DNA在细胞核内紧密压缩的第一步。整个装配过程是在蛋白质参与下精确调控的动态过程。
 
四、DNA的功能
1.DNA主要的功能是：
(1)遗传信息的传递和复制
(2)DNA具有高度稳定性同时表现出高度复杂性的特点，DNA生命遗传的物质基础也是个体生命活动的信息基础
(3)DNA可发生各种重组和突变，为自然选择提供机会
 
第三节RNA的结构与功能
RNA通常为单链线型分子，可自身回折形成局部双螺旋进而折叠，除tRNA外几乎全部细胞中的RNA均与蛋白质形成核蛋白复合物。
表2-2　三种主要RNA的比较
 
1.mRNA
（1）真核生物mRNA真核生物的mRNA前体为不均一核RNA（hnRNA），有编码区和非编码区（图2-3）。真核生物的mRNA5′-端有特殊帽结构（反式的7-甲基鸟嘌呤三磷酸核苷，m7Gppp），3′-端有多聚腺苷酸尾，去除帽、尾结构可导致mRNA迅速降解。原核生物的mRNA不具有5′帽和3′多聚A尾结构。
（2）mRNA的碱基序列决定蛋白质的氨基酸序列，mRNA是蛋白质合成中的模板。
图2-3　真核生物mRNA的结构示意图
 
 
2.tRNA
tRNA在蛋白质生物合成中作为氨基酸的载体，转运氨基酸到蛋白质合成场所，它的结构特点是：
（1）含有多种稀有碱基，包括双氢尿嘧啶（DHU）、假尿嘧啶核苷（ψ）和甲基化的嘌呤（m7G，m7A）等。tRNA分子中的稀有碱基均是转录后修饰而成的。
（2）tRNA二级结构：茎环结构又称发夹结构，酷似三叶草的形状，从5′→3′依次为：DHU环＋反密码子环＋TψC环＋CCA结构（图2-4a）。
图2-4a　tRNA的二级结构
 
①二氢尿嘧啶环具有二氢尿嘧啶（DHU），通过双螺旋区与tRNA的其余部分相连；
②反密码环具有反密码子；
③TψC环通过TψC臂与tRNA的其余部分相连；
④氨基酸臂的3′末端为—CCA-OH结构，是携带氨基酸的位点。
（3）X线衍射图像分析表明，tRNA的三级结构是倒L形的空间结构（图2-4b）。
图2-4b　tRNA的三级结构
 
 
3.核糖体RNA（rRNA）
rRNA是细胞内含量最多的RNA，与核糖体蛋白共同构成核糖体（蛋白质合成的场所）。真核生物与原核生物核糖体的组成存在差异（表2-3）。
表2-3　真核生物与原核生物核糖体的组成比较
2. 原核生物和真核生物mRNA有不同的特点：
①原核生物mRNA：多顺反子。
真核生物mRNA：单顺反子。
②原核生物mRNA：转录与翻译一般是偶联的。真核生物转录的mRNA：前体则需经转录后加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成信息体后才开始工作。
③原核生物mRNA：半寿期很短。真核生物mRNA：半寿期较长。
④原核mRNA：5＇端无帽子结构，3＇端一般无多聚A尾巴。真核生物mRNA：5＇端有帽子结构（m7GpppNm），3＇端大多数有多聚A尾巴。
 
第四节 核酸的理化性质
1.核酸的一般性质
核酸分子含有酸性的磷酸基团与碱性的碱基，为两性电解质，表现为较强的酸性。renti正常生理条件下，核酸一般带负电荷，易与金属离子结合生成可溶性盐。
 
2.核酸的紫外吸收
（1）含有共轭双键的嘌呤和嘧啶在紫外波段有较强的光吸收。
（2）在中性条件下，它们的最大吸收值在260nm附近。因此依据260nm处的吸光度（A260），可以确定出溶液中的DNA或RNA的含量。A260＝1.0相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA或RNA，或20μg/ml寡核苷酸。
（3）利用A260/A280可以判断所提取的核酸样品的纯度。纯DNA样品A260/A280为1.8，RNA纯品的A260/A280为2.0。
 
3.核酸的酸性和黏性
（1）核酸为多元酸。
（2）DNA和RNA都是线性高分子，因此它们溶液的黏滞度极大，且DNA溶液的黏滞度远大于RNA。
 
4.DNA变性与复性
（1）DNA的变性DNA变性是指某些理化因素（温度、pH、离子强度等）会导致DNA双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，并不涉及共价键断裂，使DNA双链解离为单链的现象。DNA变性只破坏其空间结构，不改变DNA的核苷酸序列。
变性后DNA的特点：增色效应，黏度降低，浮力密度升高。
 
①DNA的增色效应DNA的增色效应是指DNA变性后光吸收增加的现象。DNA的增色效应是监测DNA双链是否发生变性的一个最常用的指标。减色效应:DNA在260nm处的吸光度减小。
 
②解链温度（Tm）ΔA260达到最大变化值的一半时的温度，或者说解链过程中50%的DNA双链被打开时所对应的温度，称为解链温度（Tm）或融解温度。
Tm值的大小与DNA长短、碱基的GC含量成正比。
DNA分子的GC（鸟嘌呤、胞嘧啶）含量越高，Tm值越高；介质离子强度越高，Tm值也越高。
 
（2）DNA的复性
①DNA的复性是指当变性条件缓慢除去后，两条解离的互补链重新互补配对恢复完整的双螺旋结构的过程。
②退火是指发生热变性的DNA缓慢冷却下来后可以复性的过程。将热变性的DNA迅速冷却至4℃以下，DNA不可能发生复性。这一特性被用来保持DNA的变性状态。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越高，复性越快。
③核酸杂交是指同一溶液中的不同种类的DNA或RNA单链之间存在一定程度的碱基配对关系，可能发生配对而形成杂化双链的现象。
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